[Performance of Plasma Multigene Methylation Testing in Early Diagnosis of Colorectal Cancer].

1
资料与方法
1.1
研究对象
本研究纳入2022年7月–2024年6月在徐州医科大学附属医院就诊、临床疑似CRC患者688例。纳入标准：①年龄≥18岁，性别不限；②经过临床医师初步评估怀疑为CRC；③接受结直肠镜检查并进行活检；④临床资料完整，且具有最终明确的诊断结果；⑤受试者及家属知情同意并签署知情同意书。排除标准：①确诊患有非CRC的其他癌症，如胃癌、食管癌、乳腺癌以及肺癌等；②可能存在相同基因甲基化的疾病，如非类风湿关节炎等；③孕妇或不能耐受相关检查进行临床诊断的人群；④既往接受过结直肠癌手术、肿瘤药物治疗、新辅助治疗或放射治疗的患者；⑤研究者判断不适合入选的其他情况。收集所有入组患者的性别、年龄、最终临床诊断、结直肠癌分期等信息。本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理委员会批准（批号：XXFY2025-KL192-01）。

1.2
基因甲基化检测
患者于入组后采集肘静脉血18 mL，EDTA抗凝采血管（河北鑫乐医疗器械，冀械注准20192220083）保存于2～8 ℃恒温箱内。血浆分离采用两次离心法：首先在2～8 ℃条件下，以1600×g离心15 min；离心结束后转移上层血浆至2.0 mL离心管中，避免触及中间白膜层。随后进行第二次离心：将装有上层血浆的2.0 mL离心管在2～8 ℃条件下，以16000×g离心10 min，转移上层血浆至冻存管中备用。血浆分离过程中严禁使用离心机的急停刹车功能，以避免破坏血细胞层。采用上海鹍远医疗科技有限公司生产的核酸提取试剂Circulating Cell-free DNA Kit（spin column）（备案号：沪浦械备20180121号）及其甲基化检测样本前处理试剂盒（备案号：沪浦械备20200193号）；高灵敏双链DNA荧光定量分析试剂Qubit dsDNA HS Assay Kit（生产商：Life Technologies Corporation）及荧光定量PCR仪（Applied Biosystem 7500）对获取的血浆中的SEPTIN9、BCAN、IKZF1、BCAT1、 VAV3共5种基因进行甲基化检测。在每次实验及样本结果均符合质控要求的前提下，根据计算公式得到样本的P 值。结果判定标准为：当P≥6.0时，样本检测结果为阳性；当 P<6.0时，样本检测结果为阴性。检测过程中采用统一品牌的抗凝采血管，并实行冷链运输；实验室操作严格执行ISO15189标准；每批次检测设置阳性与阴性对照；以β-actin作为内参基因进行DNA质量监控；通过随机样本重复检测控制批次间差异(变异系数<5%)。

1.3
统计学方法
采用SPSS26.0软件进行数据分析。计量资料以表示，计数资料以例数（%）表示。采用Kappa分析评估基因甲基化与临床诊断结果的一致性（Kappa 值一致性判定标准：Kappa<0.40为一致性较差，0.40～0.59为一致性中等，0.60～0.79为一致性良好，≥0.80为一致性极高），并计算单个基因甲基化的预测效能（基于ROC曲线的AUC值）。通过logistic回归构建基于5种基因甲基化的诊断模型，并采用Bootstrap法(重复1000次)验证模型稳定性。针对5个基因的关联性检验及AUC显著性检验进行多重比较，采用Benjamini-Hochberg法校正P值，控制Ⅰ类错误。绘制ROC曲线，以曲线下面积（AUC）评估模型在结直肠癌早期预测中的诊断效能。α=0.05。

2
结果
2.1
基本资料
纳入的688例患者中，男性331例，女性357例；平均年龄为（51.94±13.71）岁；临床诊断结果显示：结直肠癌48例（Ⅰ期7例、Ⅱ期14例、Ⅲ期19例、分期不明8例）、结直肠腺瘤235例、结直肠息肉和炎症170例、其他消化道良性疾病114例、肠道未见异常121例，见表1。

2.2
基因甲基化与临床诊断的一致性检验
688例患者经过病理活检结合临床检查结果最终确诊结直肠癌患者48例。单基因甲基化检测结果与临床病理诊断的一致性分析如下：SEPTIN9基因的Kappa值为 0.464（P<0.001），BCAT1基因的Kappa值为0.504（P<0.001），IKZF1基因的Kappa值为 0.552（P<0.001），BCAN基因的Kappa值为 0.417（P<0.001），VAV3基因的Kappa值为 0.391（P<0.001）。依据Kappa值一致性判定标准，IKZF1 基因与临床诊断的一致性为中等偏上，SEPTIN9、BCAT1、BCAN基因呈中等一致性，VAV3基因接近中等一致性下限，各基因的一致性检验结果均具有统计学意义。各基因甲基化检测的灵敏度、特异度等辅助评价指标及对应的四格表原始数据分别见表2、表3。

2.3
五种基因甲基化联合检测构建的诊断模型在早期诊断结直肠癌中的效能分析
五种基因构建的诊断模型灵敏度为85.42%，特异度为93.40%，预测AUC为0.916（95%CI：0.835～0.972）。通过Bootstrap法（1000次重复）验证模型稳定性，结果显示：模型AUC的Bootstrap 95%CI为0.821～0.968，与原始AUC的95%CI（0.835～0.972）高度重叠；灵敏度的Bootstrap均值为84.76%（95%CI：78.32%～90.15%），特异度的Bootstrap均值为92.89%（95%CI：90.23%～95.11%），各项指标的Bootstrap变异系数（CV）均<3%，提示构建的联合诊断模型具有良好的稳定性和可靠性，见表4～表6、图1。

2.4
诊断模型与结直肠癌分期的一致性检验情况
基于原始数据集构建的联合诊断模型，进一步分析其在不同 CRC 分期中的诊断表现（非独立外推验证），结果显示：模型在各分期中的灵敏度分别为Ⅰ期85.71%、Ⅱ期92.86%、Ⅲ期78.95%、分期不明87.50%，提示模型对早期CRC（Ⅰ/Ⅱ期）的检出效能更优，见表7。结合Bootstrap内部验证结果（AUC的Bootstrap 95%CI与原始区间高度重叠，CV<3%），模型在各分期中的诊断表现具有良好的稳定性，未出现显著偏倚。

3
讨论
本研究通过检测血浆中SEPTIN9、BCAN、IKZF1、BCAT1和VAV3五种基因的甲基化水平，构建了一个多基因联合诊断模型用于结直肠癌的早期诊断。结果显示诊断模型在诊断效能上显著优于单一基因检测，灵敏度达到85.42%，特异度为93.40%，AUC为0.916。这一发现为结直肠癌的无创早期诊断提供了新的思路和潜在的临床应用价值。单一基因检测的灵敏度普遍较低（33.33%～52.08%），而联合模型将灵敏度提升至85.42%，同时保持了较高的特异度（93.40%）。研究发现，SEPTIN9联合SDC2甲基化检测可显著提高早期结直肠癌的检出率，灵敏度从单一基因的50%～70%提升至80%以上[11]。国外研究也表明[12]，多基因甲基化组合（如BCAT1和IKZF1）的诊断效能优于传统肿瘤标志物CEA和CA19-9。
近年来，液体活检技术在CRC早期诊断中的应用日益广泛。CancerSEEK和Guardant Health的多基因检测平台，通过结合甲基化和突变分析，实现了较高的诊断效能（AUC>0.90）[13]。国内研究则侧重于甲基化标志物的优化组合，如SEPTIN9联合SDC2或SHOX2。本研究中，SEPTIN9的灵敏度为47.92%，特异度为96.72%，AUC为0.804，与既往研究结果（灵敏度50%～70%）相符[14]。研究显示[15]，SEPTIN9甲基化与肿瘤细胞的增殖和迁移密切相关，但其灵敏度不足可能是由于其在早期肿瘤中的甲基化水平较低或存在人群异质性。BCAT1和IKZF1在本研究中的表现优于SEPTIN9，灵敏度分别为52.08%和50.00%，特异度均超过96%。BCAT1参与支链氨基酸代谢，其甲基化异常可能导致代谢重编程，促进肿瘤生长，IKZF1则通过调控免疫微环境影响肿瘤进展[16]。国外研究显示[17]，BCAT1和IKZF1甲基化在CRC早期即可被检测到，且与肿瘤分期相关，这与本研究的结果一致。BCAN和VAV3的灵敏度较低（33.33%和35.42%），但特异度较高（>97%）。BCAN编码一种细胞外基质蛋白，其甲基化可能影响肿瘤微环境的形成[18]；VAV3则参与信号传导，甲基化异常可能激活致癌通路[19]。尽管其单独诊断价值有限，但在联合模型中可能通过与其他基因的协同作用提升整体效能。
预测结直肠癌临床分期方面，本研究的诊断模型在早期CRC（Ⅰ期和Ⅱ期）中表现出色，灵敏度分别为85.71%和92.86%，高于Ⅲ期的78.95%。这一结果与CRC的生物学行为相符：早期肿瘤的甲基化特征可能更为均一，而晚期肿瘤的异质性增加[20-21]，导致检测难度加大。此外，模型对分期不明病例的灵敏度为87.50%，提示其在临床不确定病例中可能具有重要辅助诊断价值。
本研究的优势在于样本量较大，纳入了688例可疑CRC患者，且所有患者均接受了病理活检和临床检查，确保了研究结果的可靠性；且纳入的CRC患者来自我院消化内科、肿瘤科和体检中心等多个来源，年龄跨度从18～75岁，在一定程度上反映了临床实际情况。此外，本研究采用了多种基因甲基化标志物的联合检测，构建了一个诊断模型，其诊断效能显著高于单基因检测。本研究结果具有广泛的应用前景：甲基化检测成本约为结肠镜的1/5；全程耗时<48 h；仅需普通PCR仪等基础设备，适合二级以上医院开展；最后甲基化检测作为初筛工具可减少约60%的不必要结肠镜检查。
然而，本研究也存在一些局限性。首先，研究对象仅限于我院的患者，可能存在一定的选择偏倚。其次，虽然本研究的样本量较大，但与其他大规模多中心研究相比，仍显得较小。最后，本研究的随访时间较短，对于诊断模型的长期效能和临床应用价值还需要进一步验证。未来我们已经打算联合省内其他三家医院联合多中心研究进一步论证此结论。
综上所述，基于血浆SEPTIN9、BCAN、IKZF1、BCAT1和VAV3基因甲基化的多基因联合诊断模型，在结直肠癌早期诊断中表现出优异的效能，为无创筛查提供了新的工具。

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作者贡献声明　盛宁宁负责论文构思、正式分析、调查研究和初稿写作，郭毅负责经费获取、研究方法和审读与编辑写作，侯先存负责研究项目管理和监督指导，王怡裕负责调查研究、研究方法和提供资源，徐银海负责经费获取、研究项目管理和审读与编辑写作。所有作者已经同意将文章提交给本刊，且对要发表的版本进行最终定稿，并同意对工作的所有方面负责。
Author Contribution　SHENG Ningning is responsible for conceptualization, formal analysis, investigation, and writing--original draft. GUO Yi is responsible for funding acquisition, methodology, and writing--review and editing. HOU Xiancun is responsible for project administration and supervision. WANG Yiyu is responsible for investigation, methodology, and resources. XU Yinhai is responsible for funding acquisition, project administration, and writing--review and editing. All authors consented to the submission of the article to the Journal. All authors approved the final version to be published and agreed to take responsibility for all aspects of the work.
利益冲突　所有作者声明均不存在利益冲突
Declaration of Conflicting Interests　All authors declare no competing interests.